Изготовление срезов и их наклейка.
Для изготовления срезов из парафиновых блоков обычно используются два типа микротомов - санные и ротационные. В нашей стране более распространены приборы с ручным приводом (существуют и автоматизированные микротомы) . В настоящее время отечественная промышленность не производит микротомов, отвечающих высоким требованиям, предъявляемым к приборам подобного класса. Наиболее качественные приборы изготавливаются зарубежными фирмами, одной из которых является немецкая фирма PFM.
В большинстве лабораторий отдают предпочтение санным микротомам. Они проще устроены, просты в работе и обслуживании и позволяют изготавливать срезы как с парафиновых, так и с целлоидиновых блоков. Кроме того, санный микротом легко дооснащается замораживающим столиком и приспосабливается для изготовления срезов замороженных тканей.
Ротационные микротомы используют главным образом при необходимости получения тонких (1-3 мкм) срезов и для изготовления серий срезов.
При планировании иммуноцитохимических исследований использовать целлоидин-парафиновые методы заливки не рекомендуется из-за частого развития неспецифической фоновой реакции. Ее можно избежать только предварительно удалив из срезов целлоидин.
Увеличение времени пребывания в этой среде не сказывается отрицательно на качестве дальнейшей проводки и заливки.
На санном микротоме с ручным приводом невозможно стабильное получение парафиновых срезов тоньше 4 мкм, даже при использовании специальных сортов парафина.
Как в санных, так и в ротационных микротомах для изготовления срезов могут быть использованы многоразовые ножи (которые можно точить и править) и специальные одноразовые лезвия производстава Feather, Erma и др.
При изготовлении срезов их следует снимать с микротомного ножа при помощи кисточки и препаровальной иглы таким образом, чтобы не коснуться режущей кромки ножа. По окончании работы нож следует тщательно очистить от остатков срезов и кусочков прилипшего парафина при помощи тряпочки, смоченной бензином, петролейным эфиром или ксилолом. При загрязнении режущей кромки ее следует промыть бензином, а не вытирать, чтобы не повредить лезвие. Неаккуратное обращение с многоразовым ножом сокращает срок его службы. Следует помнить, что заводская заточка ножа всегда лучше, чем проведенная повторно.
Срезы с ножа обычно собирают на дистиллированную воду (реже наклеивают на предметные стекла сухим способом).
При снятии срезов на воду для обеспечения хорошего их расправления воду подогревают до 37°-40°С (так, чтобы срезы расправились без подплавления парафина). Расправленные срезы вылавливают на приготовленные предметные стекла.
Можно снимать срезы и на дистиллированную воду, помещенную на предметное стекло (обычно по 2-3 капли воды на стекло). В этом случае расправления срезов добиваются нагревая стекла с плавающими на воде срезами на нагревательном столике или над пламенем спиртовки. В последнем случае следует быть очень внимательным, чтобы не допустить перегрева и расплавления парафина, из-за чего срез может разорваться. Дальнейший перегрев может привести к нарушению тинкториальных свойств ткани.
После расправления срезов на стекле излишек воды (вокруг срезов) аккуратно удаляют фильтровальной бумагой и помещают папки с предметными стеклами в термостат (37°С) на ночь. После этого срезы могут быть окрашены.
Подготовка предметных стекол
Перед наклеиванием срезов предметные стекла должны быть подготовлены для того, чтобы в ходе дальнейшей обработки срезы не отклеивались. Не требуют специальной подготовки только предметные стекла, обработанные в заводских условиях специальными адгезивами — поли-L-лизином и аминоалкилси-ланом. Такие стекла выпускаются рядом зарубежных фирм (Sigma, Dako, Shandon, Menzel и др.). О наличии адгезивного покрытия можно судить по надписи, имеющейся на упаковке предметных стекол.
Подготовка предметных стекол к работе состоит из двух этапов — очистки (обезжиривания) и нанесения адгезивного покрытия. В настоящее время российскими производителями предметные стекла, не нуждающиеся в обезжиривании, не выпускаются. На упаковках стекол импортного производства, не нуждающихся в очистке и обезжиривании, должна быть маркировка "рге cleaned".
Очистка и обезжиривание обычных предметных стекол
Сначала предметные стекла тщательно промывают в теплой мыльной воде, прополаскивают в чистой водопроводной (а лучше дистиллированной) воде и насухо протирают неворсистой тканью (лучше льняной). Такие стекла можно завернуть в чистую бумагу и использовать по мере необходимости.
Перед работой необходимое количество предметных стекол погружают в эксикатор (или банку с притертой пробкой) с жидкостью Никифорова (этанол-эфир 1:1) или 96% этанолом. В жидкости Никифорова происходит окончательное обезжиривание стекол. Если предметные стекла, поступающие в лабораторию достаточно чистые, можно ограничиться только обезжириванием их в жидкости Никифорова или этаноле.
Для проверки качества очистки и обезжиривания на извлеченное из жидкости Никифорова и тщательно протертое сухой тканью предметное стекло нужно поместить каплю дистиллированной воды. Если вода растекается по поверхности стекла, то такие стекла можно использовать, если вода собирается в каплю — очистка стекла недостаточная или свойства поверхности стекла таковы, что срезы могут отклеиваться, даже при последующей обработке адгезивом.
Следует отметить, что чем толще срезы, тем они более склонны отклеиваться при дальнейшей обработке. Срезы могут отклеиваться при высокой температуре растворов (что может иметь место в иммуноцитохимических исследованиях и при постановке гибридизации in situ). В щелочных ваннах срезы отклеиваются чаще, чем в нейтральных и кислых.
Обработка адгезивными средами
Адгезивные среды наносятся только на очищенные и обезжиренные предметные стекла.
Среди методов увеличения адгезивных свойств предметных стекол следует остановиться на двух, наиболее распространенных. Это - обработка яичным белком с глицерином и обработка желатиной. Лучшую адгезию, чем при использовании этих двух способов, дает применение полилизина и аминоалкилсилана, однако в лабораторных условиях нанесение этих покрытий бывает не всегда успешным, поэтому, при необходимости применения таких адгезивов, лучше заказать импортные предметные стекла, обработанные в заводских условиях.
Обработка белком с глицерином
Берут свежий яичный белок (без примеси желтка), взбивают его шпателем до состояния пены и выливают на большой широкопористый фильтр, смоченный предварительно дистиллированной водой. Фильтрация продолжается около 24 ч. К профильтрованному белку прибавляют равный объем глицерина, размешивают и добавляют кусочек камфары или тимола для предупреждения загнивания. Камфору (или тимол) можно добавить и в белок во время взбивания.18 Приготовленный белок с глицерином хорошо сохраняется в бытовом холодильнике (несколько месяцев).
Обработка обезжиренных предметных стекол белком с глицерином производится непосредственно перед изготовлением срезов следующим образом. Предметные стекла извлекаются из этанола или жидкости Никифорова поочередно, тщательно протираются сухой тканью и раскладываются в необходимом количестве на папках. На каждое предметное стекло кончиком препаровальной иглы или тонкой стеклянной палочкой наносится маленькая капелька белка с глицерином. Подушечкой пальца (сухой) лаборант тщательно растирает капельку по поверхности стекла до ощущения притирания (более высокого сопротивления движению). После этого оставляют стекла в сухом помещении для подсыхания (защитив от пыли), ставят папки на непродолжительное время (15-20 мин) в термостат или проводят каждое стекло над пламенем спиртовки, добиваясь его нагревания до 50°-60°С, после чего стекла готовы для наклейки срезов.
Обработка желатином
Растворяют 2,5 г желатина в 500 мл дистиллированной воды, нагревая раствор до 50°С при постоянном помешивании. После растворения желатина добавляют 0,25 г хромокалиевых квасцов и хорошо перемешивают раствор. Охлаждают раствор до комнатной температуры и хранят при 4°С. Перед использованием раствор нагревают до 60°С и фильтруют. Помещают в раствор очищенные предметные стекла, вынимают и сушат на подставке при 60°С не менее часа. После охлаждения стекла можно использовать или хранить в коробках (для защиты от пыли).
Подготовка срезов к окрашиванию и последующая обработка
Поскольку большинство красителей не проникают в срезы, пропитанные парафином и являются водо- или спирторастворимыми веществами, парафин перед окраской препаратов должен быть удален. Этого достигают в ходе процедуры депарафинирования и регидратации.
В качестве растворителя парафина обычно используют орто-ксилол (Ч, ЧДА). Для регидратации применяют спирты (этанол) нисходящей крепости. При постановке иммуноцитохимических реакций некоторые фирмы (например Sigma) в своих протоколах рекомендуют перед депарафинированием прогреть предметные стекла в термостате (56 °С).
Проводить депарафинирование и регидратацию срезов, наливая ксилол и спирт непосредственно на предметное стекло, как это рекомендует Г.А.Меркулов, не следует, чтобы избежать токсического воздействия паров ксилола. Целесообразно использовать высокие цилиндрические стаканчики с притертыми крышками. Для депарафинирования и регидратации достаточно пяти стаканчиков. В первые два наливают орто-ксилол. Затем следуют две порции 96%-го этанола и 80%-го этанол. В каждой порции ксилола предметные стекла следует оставить на 3-5 минут. В спирты стекла следует помещать на 2-3 минуты. При перекладывании стекол следует аккуратно промокать их торцевую часть о фильтровальную бумагу, чтобы не загрязнять последующие растворы. Депарафинировать и регидратировать предметные стекла, сложенные по два (срезами наружу) не следует из-за опасности занесения ксилола, который может остаться между стеклами, в спирты и воду. Из 80%-го спирта предметные стекла переносят в дистиллированную воду на 5 (или более) минут. На этом регидратация срезов завершается и можно приступать к окраске.
Дегидратация, просветление и заключение срезов после окраски
После завершения окраски необходимо получить препарат, пригодный для микроскопического исследования. С этой целью используют застывающие прозрачные среды, которые помещают на окрашенный срез и накрывают чистым покровным стеклом длинной 22 мм. Приготовленный таким образом препарат после микроскопирования может длительно сохраняться в архиве.
Если заключающая среда растворима в воде, то на окрашенные препараты наносят такую среду сразу после промывки и осторожно (чтобы избежать появления пузырьков воздуха) накрывают покровным стеклом. Когда заключающая среда застывает, препарат можно исследовать под микроскопом. Примером простой водорастворимой заключающей среды является глицерин-желатина. Ее и другие водорастворимые среды используют чаще при работе с криостатными и замороженными и вибратомными срезами, а также при окраске красителями, экстрагирующимися в этаноле.
Для заключения парафиновых срезов чаще всего используют природные смолы (канадский или пихтовый бальзамы, даммарлак) и синтетические среды (биомаунт, полистирол, капрат целлюлозы, DPX, пермаунт), которые нерастворимы в воде, но растворяются в ксилоле. Наиболее распространенными заключающими средами являются канадский бальзам и полистирол. Перед заключением в такие среды срезы необходимо обезводить в спиртах восходящей крепости (например в 80%, 96%, 100% этанолах, абсолютном этаноле-ксилоле 1:1 по 1-3 мин) и просветлить в двух порциях орто-ксилола (1-3 мин). Ксилолы и спирты рекомендуется менять после проводки каждых 40-50 препаратов. Канадский бальзам можно приобретать готовым к применению или в сухом виде. В последнем случае его растворяют в орто-ксилоле до получения густой сиропообразной жидкости.
Для приготовления заключающей среды из полистирола удобно пользоваться рецептурами Д.С.Саркисова (70 мл орто-ксилола, 30 г полистирола, 6 мл дибутилфталата) и Р.Д.Лилли (70 мл орто-ксилола, 25 г полистирола и 5 мл дибутилфталата). Для ускорения растворения полистирола смесь можно поместить в плотно закрытой бутыли в термостат (37 °С). Следует отметить, что не все сорта полистирола пригодны для приготовления заключающей среды, поскольку иногда пластификатор при взаимодействии с растворенными в полистироле примесями образует опалесцирующую при застывании взвесь.
Для заключения постоянных препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, которые предполагается длительно сохранять в архиве (десятки лет), следует предпочесть канадский бальзам. При работе с препаратами, окрашенными основными анилиновыми красителями, следует использовать полистирол или другую нейтральную заключающую среду (в канадском бальзаме и других природных смолах анилиновые красители быстро выцветают).
Если предполагается исследовать полученные препараты с помощью флуоресцентного или лазерного конфокального микроскопов, то использовать заключающие среды на основе природных смол нельзя (они обладают собственной флуоресценцией).
